Tinjauan Pustaka mengenai Hidrolisis Protein

 

Tinjauan Pustaka Hidrolisis Protein

 

Hidrolisis protein adalah proses pemecahan protein menjadi asam amino melalui pemecahan ikatan peptida. Proses ini dapat terjadi secara alami melalui reaksi dengan air atau melalui aksi enzim hidrolitik. Hidrolisis protein dengan air melibatkan reaksi kimia di mana air bereaksi dengan ikatan peptida dalam protein, menyebabkan pemecahan ikatan dan pembentukan rantai peptida yang lebih kecil. Sementara itu, hidrolisis protein melalui enzim hidrolitik melibatkan enzim-enzim seperti protease yang secara spesifik memecah ikatan peptida dalam protein. Hasil hidrolisis protein adalah asam amino, yang penting dalam proses pencernaan, penyerapan nutrisi, serta pembentukan dan pemeliharaan jaringan tubuh.

Ada tiga metode yang umum digunakan dalam proses hidrolisis.  Hidrolisis asam, hidrolisis basa dan hidrolisis enzimatik.

 

Hidrolisis Asam

Asam sulfat dan asam klorida paling sering digunakan dalam hidrolisis asam parsial;  asam asetat juga digunakan.  Asam pekat atau asam yang diencerkan juga dapat digunakan;  dibutuhkan waktu yang lebih singkat untuk mencapai tingkat hidrolisis yang sama dengan asam yang lebih pekat (English dan Grulke, 1934, Light, 1967). Waktu hidrolisis juga berkurang jika reaksinya dilakukan pada temperatur tinggi.  Misalnya, jika hidrolisis dilakukan menggunakan asam klorida dengan  normalitas 5.7N pada suhu 37°C, diperlukan waktu 3 hari untuk menghidrolisis.  Sebaliknya, menggunakan asam klorida dengan  konsentrasi yang sama, tetapi suhu yang digunakan 100°C, waktu hidrolisis dipersingkat menjadi  20-30 menit (Light, 1967, Ricks et al., 1977).

Pemilihan kondisi reaksi uhidrolisis asam sangat tergantung pada bahan baku.  Jika hidrolisat akan digunakan dalam makanan, kandungan protein dan rasa sangat penting, sehingga hidrolisis mungkin tidak sekuat atau sepanjang itu. (Prendergast, 1974).  Hidrolisis asam juga dapat digunakan untuk menentukan kandungan protein dalam makanan; dalam hal ini hidrolisis dilakukan sampai selesai, menggunakan asam klorida Hidrolisis juga dapat digunakan untuk menentukan kandungan protein dalam makanan; dalam hal ini hidrolisis dilakukan sampai selesai, menggunakan 6N asam klorida pada suhu 137°C dan untuk jangka waktu bervariasi antara 12 hingga 96 jam. pada suhu 137°C dan untuk jangka waktu bervariasi antara 12 hingga 96 jam Davies dan Thomas, 1973). Untuk penggunaan dalam makanan, biaya hidrolisis harus relatif rendah dan hidrolisat harus menghasilkan rasa yang meningkatkan atau memperkuat rasa alami. Prendergast (1974) melaporkan bahwa asam sulfat menghasilkan produk bebas garam tetapi dengan rasa yang agak keras. Selain itu, volume besar kalsium sulfat harus disaring setelah netralisasi, yang menghasilkan rendemen rendah dan produk yang relatif mahal. Oleh karena itu, asam sulfat umumnya digunakan terutama dalam produksi produk makanan khusus dan suplemen. Asam klorida umumnya lebih disukai, tetapi hidrolisat selalu mengandung natrium atau kalium klorida, yang terbentuk saat asam-asam tersebut dinetralkan.

Hidrolisis Basa

Hidrolisis alkali tidak menghasilkan rasa yang enak, tetapi dapat digunakan untuk analisis untuk menentukan kandungan asam amino. Beberapa asam amino seperti sistein dan arginin sepenuhnya hancur. Triptofan, yang dihancurkan oleh hidrolisis asam total, dapat sepenuhnya dipulihkan oleh hidrolisis alkali total (Andrews dan Baldar, 1985).

Hidrolisis total dilakukan menggunakan natrium hidroksida 4,2N atau hidroksida barium; waktu hidrolisis tergantung pada asam amino yang diminati. Pemulihan rendah dari semua asam amino, kecuali triptofan, diamati untuk waktu hidrolisis antara 1 hingga 10 jam. Jika hidrolisis dilanjutkan selama 16 jam, pemulihan sebesar 85-90% dari sistein, tirosin, dan glutamin, serta pemulihan sebesar 95-100% dari prolin, valin, leusin, dan triptofan  (Davies dan Thomas, 1973).

 

Hidrolisis Enzimatik

Hidrolisis enzimatik umumnya lambat, cukup mahal, dan jarang dilakukan sampai selesai. Protein alami memiliki struktur berbentuk globular dan ikatan peptida dalam protein tersebut tidak sepenuhnya dapat diakses oleh enzim untuk diserang. Reaksi ini juga lambat karena dilakukan pada suhu yang lebih rendah yang dapat ditoleransi oleh enzim.

Protein yang digunakan dalam makanan dihidrolisis secara enzimatik untuk meningkatkan fungsionalitasnya. Fungsionalitas dapat diubah oleh berbagai jenis enzim, tetapi sebagian besar menggunakan protease (Adler-Nissen, 1976). Tingkat proteolisis tidak hanya bergantung pada struktur primer protein, tetapi juga pada struktur sekunder dan tersier. Lipatan protein dalam beberapa sistem dapat mengurangi aksesibilitas ikatan tertentu, yang dapat dengan mudah terbelah ketika rantai diuraikan. Hidrolisis rantai insulin, misalnya, terutama melibatkan struktur primer, dan oleh karena itu tergantung terutama pada sifat kinetik protease (Ronca et al., 1975). Pencernaan miosin oleh tripsin mengakibatkan pemotongan hanya 59% dari ikatan yang rentan, menunjukkan bahwa inti protein tahan atau dicerna dengan sangat lambat (Mihalyi dan Harrington, 1959). Jika suatu protein sangat tidak larut karena struktur globularnya, ikatan peptida dapat terbelah dengan kecepatan lambat sampai bagian dalam molekul protein menjadi dapat diakses oleh enzim melalui pemotongan sebelumnya.

Hidrolisis protein kedelai oleh Penicillium duponti (Constantinides dan Adu-Amankwa, 1980) melibatkan pemotongan protein yang tidak larut dan agregat yang sebagian larut. Polipeptida yang sebagian larut dihidrolisis dalam reaksi cepat menjadi peptida-peptida larut yang lebih kecil, sedangkan inti protein yang lebih padat terlarutkan oleh enzim yang terserap dalam reaksi yang lebih lambat.

Kecepatan produksi protein kedelai yang larut mulai berkurang. Namun, konsentrasi substrat masih cukup tinggi untuk menghindari kehabisan substrat. Pelarutan tidak meningkat secara signifikan dengan penambahan enzim lebih lanjut, tetapi meningkat jika larutan penyangga dihilangkan, dan hidrolisis dilanjutkan dengan mengaduk kembali zat padat. Efek ini dapat disebabkan oleh adanya hambatan produk (Constantinides dan Adu-Amankwa, 1980).

 

Mekanisme

Linderstrom-Lang mengusulkan bahwa hidrolisis protein dapat dijelaskan dengan dua jenis urutan reaksi. Ini disebut mekanisme "satu per satu" dan "zipper". Gambar 1 menunjukkan ide dasar di balik kedua mekanisme ini (Adler-Nissen, 1976).

Reaksi "satu per satu" disebut demikian karena enzim menghidrolisis satu rantai pada satu waktu. Ini akan terjadi jika aksesibilitas ikatan meningkat seiring dengan proses pemotongan. Jika langkah "denaturasi" pertama, yang direpresentasikan sebagai langkah yang dapat terbalik dalam Gambar 1, menentukan laju reaksi, maka hanya protein asli dan produk akhir yang terdeteksi (Adler-Nissen, 1985).

Gambar 1. Model satu per satu dan tipe zipper oleh Linderstrom-Lang. Protein asli ditandai dengan lingkaran, protein terdenaturasi dengan persegi panjang, peptida dengan persegi panjang kecil yang berbeda panjangnya sesuai dengan panjang rantai. Bulan sabit melambangkan serangan enzimatik (Adler-Nissen, 1976).

Sebaliknya, reaksi "zipper" terjadi ketika protein asli mudah terdenaturasi dan sejumlah besar ikatan terbuka. Enzim dapat memotong pada beberapa situs yang berbeda, tetapi jika laju pemotongan lambat, akan terjadi penumpukan produk intermediate, karena produk akhir terbentuk dengan lambat.

Sebagian besar reaksi hidrolisis akan menjadi kombinasi dari kedua mekanisme tersebut. Satu mekanisme mungkin lebih disukai daripada yang lain tergantung pada sifat dan konsentrasi substrat dan enzim; pH dan suhu juga dapat memainkan peran (Adler-Nissen, 1976).

 

Penggunaan hidrolisat

Dalam hidrolisis enzimatik, masalah utama adalah hidrolisis berlebihan yang mengakibatkan pembentukan "peptida pahit". Rasa pahit tidak dapat diterima jika hidrolisat tersebut digunakan dalam makanan. Peptida pahit dapat dihindari dengan mengendalikan tingkat hidrolisis dan dengan demikian mengurangi pembentukan peptida berbobot molekul rendah.

 

Gelatin dan albumin telur digunakan sebagai agen pengembang dalam makanan penutup, tetapi tidak digunakan untuk memberikan rasa karena hidrolisat ini memiliki rasa yang relatif hambar (Prendergast, 1974).

 

Protein kedelai digunakan sebagai bahan dalam makanan dengan pH rendah, tetapi harus dibuat lebih enak dan profil kelarutannya harus ditingkatkan. Akibat tingkat hidrolisis sebesar 10%, protein kedelai telah larut sebesar 65-75% pada pH 8 dan suhu 50°C (Olsen dan Adler-Nissen, 1979b). Hidrolisat protein kedelai dapat digunakan dalam minuman ringan untuk meningkatkan nilai gizinya (Adler-Nissen, 1977).

Aplikasi makanan lainnya terdapat dalam bidang gangguan pencernaan, misalnya ketika enzim pankreas tidak mencukupi. Hidrolisat enzimatik telah digunakan dalam pengobatan fibrosis kistik. Protein disediakan dalam bentuk pra-dipecah karena usus kecil terganggu. Contoh dari aplikasi tersebut adalah penggunaan susu skim dan kasein (Clegg, 1977, Adler-Nissen, 1977).

 

Sebagai konsekuensi dari aplikasi sukses beberapa hidrolisat makanan, ada motivasi untuk menyelidiki sumber protein kaya lainnya, asalkan rasa pahit dapat dihindari selama hidrolisis, misalnya hidrolisat protein ikan.

 

Hidrolisis dari tepung gluten jagung, yaitu konsentrat protein jagung, merupakan sumber protein yang baik, tetapi sifatnya tidak ideal untuk tujuan ini. Adler-Nissen (1978a) melaporkan modifikasi yang berhasil dari tepung gluten jagung menggunakan Alcalase 0.6L, tanpa menciptakan peptida pahit. Namun, hidrolisis dilakukan hanya pada tepung gluten jagung dari satu pemasok. Oleh karena itu, tidak dapat dikecualikan bahwa beberapa kesimpulan mungkin khusus untuk tepung gluten jagung tertentu yang digunakan.

 

Konsentrasi substrat tertinggi yang digunakan adalah 8% w/w protein karena peningkatan viskositas yang besar (lebih dari sepuluh kali lipat) selama hidrolisis. Konsentrasi protein yang lebih tinggi tidak dapat digunakan karena masalah agitasi yang mungkin terjadi. Tidak ada laporan tentang penggunaan hidrolisat sebagai tambahan protein dalam makanan.

 

Metode Hidrolisis pH Stat

 

Prinsip

Derajat hidrolisis, yang sebenarnya merupakan persentase ikatan peptida yang terpecahkan, dapat diukur dengan memonitor penambahan basa yang diperlukan untuk mempertahankan pH selama hidrolisis (Adler-Nissen, 1985). Grup karboksil bebas dan gugus amino bebas dapat atau tidak dapat terionisasi, tergantung pada pH dan sejauh mana suhu reaksi. Pada suhu 25°C, pK dari grup karboksil dalam polipeptida berada antara 3,1 dan 3,6, dan pK dari gugus amino berada antara 7,5 dan 7,8 (Adler-Nissen, 1985). Jika reaksi berlangsung pada pH 8 dan suhu 25°C, grup karboksil akan sepenuhnya terdisosiasi dan gugus amino akan sebagian terprotonasi (Eriksen, 1982a). Oleh karena itu, hidrolisis menghasilkan pelepasan proton di mana stoikiometri tergantung pada tingkat protonasi gugus amino α.

Derajat protonasi dari gugus amino α dapat dinyatakan dalam hal pK dari gugus amino pada pH dan suhu tertentu, serta pH sistem. Derajat disosiasi a meningkat dengan meningkatnya suhu, pKa dari gugus amino pada pH 8 dan suhu 25°C adalah 7,7, tetapi pada suhu 50°C pKa turun menjadi 7,1 (Eriksen, 1982a, Adler-Nissen, 1982).

Sebuah protein terdiri dari sejumlah ikatan peptida yang secara teoritis dapat semuanya terpecahkan untuk memberikan derajat hidrolisis 100%. Jumlah total ikatan peptida dalam protein tertentu dapat dihitung dari komposisi asam amino dalam mmol dari masing-masing asam amino per g protein (Adler-Nissen, 1985). Jumlah total ikatan peptida ditandai dengan htot.

Alat pH stat digunakan untuk menentukan jumlah sebenarnya dari ikatan peptida per g yang terpecahkan selama hidrolisis.

Ketika hidrolisis dilakukan pada kondisi netral atau sedikit basa, derajat hidrolisis (DH) dapat terus dipantau. Tanpa menggunakan teknik pH stat, pH akan turun seiring dengan berjalannya hidrolisis, seperti yang ditunjukkan dalam persamaan (2). Teknik pH stat melibatkan penambahan basa, seperti natrium hidroksida, untuk menjaga pH tetap konstan. Konsumsi basa adalah sebanding dengan ekuivalen hidrolisis, h. Nilai h diberikan oleh persamaan (Eriksen, 1982b):

 

h = B x Nb x (-1)^(1/a) x (-MP)

 

Di mana:

h adalah ekuivalen hidrolisis,

B adalah jumlah basa yang dikonsumsi (dalam mmol),

Nb adalah normalitas basa,

a adalah derajat protonasi gugus amino α,

MP adalah massa protein yang terhidrolisis.

 

Dengan menggunakan teknik pH stat dan memantau konsumsi basa, kita dapat menghitung ekuivalen hidrolisis dan memonitor kemajuan hidrolisis secara langsung. Hal ini memungkinkan pengendalian proses hidrolisis untuk mendapatkan derajat hidrolisis yang diinginkan dalam kondisi yang diinginkan.

Cara Penggunaan

pH stat meter membutuhkan elektroda pH yang dicelupkan ke dalam sistem reaksi. Elektroda pH terhubung ke pengukur pH, yang pada gilirannya terhubung ke pengontrol yang dapat diatur.

Buret yang digerakkan oleh motor bertanggung jawab untuk pengiriman titran, baik asam maupun basa. Salah satu ujung buret juga harus dicelupkan ke dalam sistem reaksi. Pengontrol dapat diatur untuk menjaga nilai pH tertentu. Jika pH menyimpang dari nilai yang diinginkan, titran ditambahkan hingga pH asli dipulihkan (Jacobsen et al., 1957). Konsumsi basa dapat dicatat dengan waktu menggunakan perekam.

Pengontrol memulai buret yang digerakkan oleh motor ketika potensial keluaran dari pengukur pH menyimpang dari nilai yang diinginkan. Pengontrol berhenti ketika pH kembali ke nilai aslinya.

Pengontrol ini merupakan pengontrol proporsional. Keuntungan dari ini adalah bahwa di dekat titik set, jumlah titran yang ditambahkan lebih sedikit, dan penambahan berhenti ketika titik set tercapai.

Karbondioksida dari atmosfer dapat memperkenalkan beberapa kesalahan dalam pengukuran derajat hidrolisis ketika pH stat beroperasi pada pH basa. Adler-Nissen (1985) menunjukkan bahwa, untuk muatan 1 liter yang beroperasi pada pH 9 dan 50°C, kurang dari 0,08 mol karbondioksida diserap selama eksperimen empat jam. Oleh karena itu, diasumsikan bahwa penyerapan karbondioksida diabaikan dibandingkan dengan jumlah titran yang dikonsumsi selama hidrolisis. Penyerapan karbondioksida dapat dihindari jika gas inert seperti nitrogen dialirkan melalui sistem.

Model Hidrolisis

Pendekatan Michaelis-Menten dalam kinetika enzim telah banyak digunakan. Konstanta kinetik dalam percobaan hidrolisis protein pangan dievaluasi menggunakan pendekatan yang berbeda untuk sistem enzim larut dan substrat tidak larut.

Sebuah model kinetik menyediakan pemahaman mekanistik tentang hidrolisis enzimatik. Dengan substrat makromolekul, model lengkap dari sistem dapat menjadi sangat kompleks. Dalam kebanyakan kasus, beberapa asumsi yang valid akan menghasilkan model yang lebih dapat dikelola, namun masih mewakili mekanisme dengan memadai untuk tujuan desain reaktor.

Sebuah model statistik yang menggunakan persamaan laju empiris juga dapat diterapkan pada isolat kedelai. Meskipun informasi tentang mekanisme hilang, presisi sangat baik untuk optimasi dan desain proses hidrolisis.

 

Model-model Kinetik

Berbagai model kinetik telah diterapkan pada sistem enzim larut dan substrat tidak larut. Hidrolisis enzimatik protein kedelai (Constantinides dan Adu-Amankwa, 1980) dan protein daging tanpa lemak (O'Meara dan Munro, 1985) dimodelkan menggunakan model hambatan produk Michaelis-Menten. Sebagai alternatif, penyerapan enzim pada substrat (metode penyerapan Freundlich) diikuti oleh hidrolisis berikutnya digunakan untuk memodelkan hidrolisis enzimatik hidrolisat protein ikan (Archer et al., 1973). Hidrolisis rantai teroksidasi dari insulin A dan B dimodelkan sebagai dua reaksi paralel simultan (Montali et al., 1980). Tidak jelas model kinetik mana yang mungkin sesuai dengan data eksperimental sampai sistem tersebut diteliti secara teliti.

Model Michaelis-Menten

Sistem substrat tidak larut dapat dimodelkan menggunakan mekanisme yang serupa dengan yang digunakan untuk hidrolisis substrat larut.

Model yang digunakan oleh Constantinides dan Adu-Amankwa (1980) memodifikasi persamaan Michaelis-Menten untuk memperhitungkan hambatan produk dan dapat direpresentasikan oleh mekanisme berikut:

Persamaan (7) mewakili proses multi-langkah di mana intermediat S dihasilkan dan terdegradasi lebih lanjut. Persamaan (8) mewakili hambatan produk, di mana sebagian produk secara kompetitif mengikat enzim. Persamaan (9) mewakili inaktivasi enzim. S_i-j mewakili semua "intermediat", dengan berbagai berat molekul, dalam hidrolisis. Dengan cara yang sama, p mewakili sekelompok peptida berat molekul yang lebih kecil namun bervariasi.

 

Model mekanistik serupa digunakan untuk hidrolisis enzimatik protein daging tanpa lemak yang tidak larut menggunakan protease Alcalase 0.6L (O'Meara dan Munro, 1985) dan juga hidrolisis selulosa oleh Trichoderma viride (Howell dan Stuck, 1975).

Model adsorpsi Freundlich

Model kinetik ini pertama-tama mempertimbangkan penyerapan enzim pada substrat yang tidak larut, yang dievaluasi menggunakan isoterma adsorpsi Freundlich. Penyerapan enzim kemudian digabungkan dengan ekspresi kinetik untuk hidrolisis. Hidrolisis enzimatik konsentrat protein ikan, pati, dan selulosa (Archer et al., 1973, McLaren, 1963) semuanya telah dimodelkan dengan cara ini.

Reaksi simultan orde pertama

Metode alternatif yang diterapkan pada hidrolisis rantai teroksidasi insulin A dan B adalah dengan mempertimbangkan dua reaksi simultan orde pertama (Mihalyi dan Harrington, 1959, Ronca et al., 1975). Enzim subtilisin Carlsberg digunakan untuk hidrolisis ini; enzim ini memiliki spesifisitas yang sangat luas. Kinetika reaksi tersebut diikuti menggunakan teknik pH stat, yang sayangnya tidak dapat mendeteksi reaksi terpisah. Oleh karena itu, jumlah kedua reaksi seiring waktu diukur. Adanya dua reaksi simultan diidentifikasi melalui analisis kinetik.

 

Dua reaksi simultan terdiri dari reaksi cepat dan reaksi lambat, di mana proteolisis ikatan peptida satu kelas adalah reaksi yang cepat. Ikatan ini diidentifikasi sebagai CyS(0₃H)-Ser dan Leu-Tyr. Kelas ikatan lainnya dipotong lebih lambat sesuai dengan reaksi orde pertama. Situs pemotongan dalam kasus ini adalah Leu-Glu, Asn-Tyr, dan Try-Cys(0₃H) (Montali et al., 1980). Ikatan yang dipotong secara lambat lainnya juga diidentifikasi sebagai Glu-Gln (Ronca et al., 1975). Ronca et al. (1975) menyatakan bahwa proteolisis terbatas pada situs lain juga mungkin terjadi, karena spesifisitas yang luas dari subtilisin Carlsberg.

 

Konstanta laju dievaluasi dengan memplotkan logaritma alami laju proteolisis terhadap waktu. Laju proteolisis dinyatakan sebagai laju konsumsi basa (dP/dt) yang diukur oleh pH stat. Umumnya disimpulkan bahwa reaksi cepat selesai sebelum sebagian besar reaksi lambat terjadi secara signifikan (Mihalyi dan Harrington, 1959).

Model statistik

Model statistik (Adler-Nissen, 1985) tidak memberikan informasi tentang mekanisme hidrolisis, tetapi digunakan sebagai perbandingan empiris antara kurva hidrolisis untuk tujuan optimasi proses. Model statistik membandingkan kurva hidrolisis eksperimental dengan kurva hidrolisis standar yang telah ditentukan. Faktor skala digunakan untuk mengkoreksi skala waktu untuk setiap perbedaan antara kurva eksperimental dan kurva standar. Perbedaan antara kurva dapat disebabkan oleh suhu hidrolisis yang berbeda atau konsentrasi enzim yang berbeda, misalnya. Teknik statistik digunakan untuk membandingkan kurva hidrolisis, karena kesalahan eksperimental serta kondisi reaksi akan menyebabkan perbedaan antara kedua kurva hidrolisis.

 

Model analisis statistik mengandalkan fakta bahwa hanya satu enzim yang hadir, dan konsentrasi substrat cukup tinggi untuk memastikan bahwa enzim jenuh dengan substrat sepanjang hidrolisis (Adler-Nissen, 1985).

 

Model ini telah diterapkan pada hidrolisis isolat kedelai menggunakan Alcalase. Namun, model ini tidak dapat diterapkan pada tepung gluten jagung, di mana enzim mungkin tidak jenuh dengan substrat sepanjang hidrolisis. Karena itu, penerapan model ini tidak dilanjutkan.

Berbagi :